belajar desain vektor

Vektor virus adalah alat yang umum digunakan oleh para ahli biologi molekuler untuk menyampaikan materi genetik ke dalam sel . Proses ini dapat dilakukan di dalam organisme hidup ( in vivo ) atau dalam kultur sel ( in vitro ) . Virus telah berevolusi mekanisme molekuler khusus untuk efisien transportasi genom mereka di dalam sel mereka menginfeksi . Pengiriman gen oleh virus disebut transduksi dan sel-sel yang terinfeksi digambarkan sebagai transduced . Para ahli biologi molekuler pertama dimanfaatkan mesin ini pada tahun 1970. Paul Berg menggunakan virus SV40 dimodifikasi mengandung DNA dari bakteriofag lambda untuk menginfeksi sel-sel ginjal monyet dipertahankan dalam budaya . [ 1 ]Sifat utama dari vektor virus [sunting ]
Vektor virus ini dirancang untuk aplikasi khusus mereka tetapi umumnya berbagi sifat kunci .

    * Keamanan : Meskipun vektor virus kadang-kadang dibuat dari virus patogen , mereka dimodifikasi sedemikian rupa untuk meminimalkan risiko menangani mereka . Hal ini biasanya melibatkan penghapusan bagian dari genom virus penting untuk replikasi virus . Seperti virus efisien dapat menginfeksi sel tetapi, setelah infeksi telah terjadi , memerlukan virus pembantu untuk menyediakan protein yang hilang untuk produksi virion baru .
    * Rendah Toksisitas : The vektor virus harus memiliki efek minimal terhadap fisiologi sel menginfeksi .
    * Stabilitas : Beberapa virus secara genetik tidak stabil dan dapat dengan cepat mengatur ulang genom mereka . Hal ini merugikan prediktabilitas dan kemampuan untuk memproduksi karya dilakukan menggunakan vektor virus dan dihindari dalam desain mereka .
    * Jenis sel spesifisitas : Sebagian besar vektor virus yang direkayasa untuk menginfeksi selebar berbagai jenis sel mungkin. Namun, terkadang sebaliknya lebih disukai . Reseptor virus dapat dimodifikasi untuk menargetkan virus untuk jenis tertentu sel . Virus dimodifikasi dengan cara ini dikatakan pseudotyped .
    * Identifikasi : vektor Viral sering diberikan gen tertentu yang membantu mengidentifikasi sel-sel mengambil gen virus . Gen ini disebut Marker . Sebuah penanda umum adalah resistensi antibiotik terhadap antibiotik tertentu . Sel-sel kemudian dapat diisolasi dengan mudah karena mereka yang belum diambil gen virus vektor tidak memiliki resistensi antibiotik sehingga tidak dapat tumbuh dalam budaya dengan antibiotik hadir.
Aplikasi [sunting ]Penelitian Dasar [ sunting]
Vektor virus pada awalnya dikembangkan sebagai alternatif untuk transfeksi DNA telanjang untuk genetika molekuler percobaan . Dibandingkan dengan metode tradisional seperti presipitasi kalsium fosfat , transduksi dapat memastikan bahwa hampir 100 % dari sel-sel yang terinfeksi tanpa sangat mempengaruhi kelangsungan hidup sel . Selain itu, beberapa virus mengintegrasikan ke dalam genom sel memfasilitasi ekspresi stabil .
Namun, transfeksi masih merupakan metode pilihan untuk banyak aplikasi sebagai konstruksi vektor virus adalah proses yang jauh lebih sulit .
Protein coding gen dapat dinyatakan dengan menggunakan vektor virus , umumnya untuk mempelajari fungsi protein tertentu . Vektor virus , terutama retrovirus , stabil mengekspresikan gen penanda seperti GFP banyak digunakan untuk secara permanen label sel untuk melacak mereka dan keturunan mereka , misalnya dalam percobaan xenotransplantation , ketika sel-sel yang terinfeksi in vitro yang ditanamkan ke dalam hewan inang .
Gene penyisipan lebih murah untuk melaksanakan daripada KO gen . Tapi seperti membungkam kadang-kadang tidak spesifik dan memiliki efek off-target pada gen lain , memberikan hasil yang kurang dapat diandalkan . Vektor hewan inang juga memainkan peran penting .Terapi gen [ sunting]Artikel utama: Terapi gen
Terapi gen adalah teknik untuk mengoreksi gen cacat yang bertanggung jawab untuk perkembangan penyakit . Di masa depan, terapi gen dapat memberikan cara untuk menyembuhkan kelainan genetik , seperti immunodeficiency gabungan yang parah , fibrosis kistik atau bahkan Hemofilia A. Karena penyakit ini hasil dari mutasi pada urutan DNA untuk gen tertentu , percobaan terapi gen telah menggunakan virus untuk mengirimkan salinan unmutated gen ke sel-sel tubuh pasien . Ada sejumlah besar keberhasilan laboratorium dengan terapi gen . Namun, beberapa masalah terapi gen virus harus diatasi sebelum keuntungan digunakan secara luas . Respon kekebalan terhadap virus tidak hanya menghambat pengiriman gen untuk menargetkan sel tetapi dapat menyebabkan komplikasi parah bagi pasien . Dalam salah satu percobaan terapi gen awal tahun 1999 ini menyebabkan kematian Jesse Gelsinger , yang dirawat menggunakan vektor adenoviral . [ 2 ]
Beberapa vektor virus , misalnya lentivirus , masukkan genom mereka di lokasi acak di salah satu kromosom inang , yang dapat mengganggu fungsi gen seluler dan menyebabkan kanker . Dalam immunodeficiency gabungan percobaan terapi gen retroviral berat yang dilakukan pada tahun 2002 , empat dari pasien mengembangkan leukemia sebagai konsekuensi dari pengobatan ; [ 3 ] tiga pasien pulih setelah kemoterapi [ 4 ] vektor berbasis virus Adeno terkait jauh lebih aman . dalam hal ini karena mereka selalu mengintegrasikan di tempat yang sama dalam genom manusia . Vektor juga disebut kendaraan .Vaksin [sunting ]
Virus mengekspresikan protein patogen saat ini sedang dikembangkan sebagai vaksin terhadap patogen ini , didasarkan pada alasan yang sama seperti vaksin DNA . T - limfosit mengenali sel yang terinfeksi dengan parasit intraseluler berdasarkan protein asing yang dihasilkan di dalam sel . Imunitas sel T sangat penting untuk perlindungan terhadap infeksi virus dan penyakit seperti malaria . Sebuah vaksin virus menginduksi ekspresi protein patogen dalam sel inang yang sama dengan vaksin Sabin Polio dan vaksin dilemahkan lainnya . Namun, sejak vaksin virus hanya berisi sebagian kecil dari gen patogen , mereka jauh lebih aman dan infeksi sporadis oleh patogen adalah mustahil . Adenovirus sedang aktif dikembangkan sebagai vaksin .Jenis vektor virus [sunting ]Retrovirus [sunting ]Artikel utama: Retroviruses
Retrovirus adalah salah satu andalan pendekatan terapi gen saat ini . Retrovirus rekombinan seperti Moloney murine leukemia virus memiliki kemampuan untuk mengintegrasikan ke dalam genom inang dengan cara yang stabil . Mereka mengandung reverse transcriptase yang memungkinkan integrasi ke dalam genom inang . Mereka telah digunakan dalam sejumlah uji klinis yang disetujui FDA seperti sidang SCID - X1 . [ 5 ]
Vektor retroviral dapat menjadi replikasi - kompeten atau replikasi -cacat . Vektor replikasi -cacat adalah pilihan yang paling umum dalam studi karena virus memiliki daerah coding untuk gen yang diperlukan untuk putaran tambahan replikasi virion dan kemasan diganti dengan gen lain , atau dihapus . Virus ini mampu menginfeksi sel target mereka dan memberikan muatan virus mereka , tapi kemudian gagal untuk melanjutkan jalur litik khas yang mengarah ke lisis sel dan kematian .
Sebaliknya, vektor virus replikasi - kompeten berisi semua gen yang diperlukan untuk sintesis virion , dan terus menyebarkan diri setelah infeksi terjadi . Karena genom virus untuk vektor ini jauh lebih panjang , panjang gen yang disisipkan sebenarnya bunga terbatas dibandingkan yang mungkin panjang insert untuk vektor replikasi -cacat . Tergantung pada vektor virus , panjang maksimum khas dari DNA yang diijinkan memasukkan dalam vektor virus replikasi -cacat biasanya sekitar 8-10 kB . [ 6 ] Sementara ini membatasi pengenalan banyak urutan genom , yang paling urutan cDNA masih dapat ditampung .
Kelemahan utama untuk menggunakan retrovirus seperti retrovirus Moloney melibatkan persyaratan bagi sel untuk secara aktif membagi untuk transduksi . Akibatnya , sel-sel seperti neuron sangat tahan terhadap infeksi dan transduksi oleh retrovirus . Ada kekhawatiran bahwa mutagenesis insersional karena integrasi ke dalam genom inang mungkin menyebabkan kanker atau leukemia . Kekhawatiran ini tetap teoritis sampai terapi gen untuk sepuluh pasien SCID - X1 menggunakan Maloney murine leukemia virus [ 7] menghasilkan dua kasus leukemia disebabkan oleh aktivasi onkogen LMO2 karena integrasi terdekat vektor . [ 8 ]Lentivirus [sunting ]Artikel utama: LentivirusKemasan dan transduksi oleh vektor lentiviral .
Lentivirus adalah subclass dari Retrovirus . Mereka baru-baru ini diadaptasi sebagai kendaraan pengiriman gen ( vektor ) berkat kemampuan mereka untuk mengintegrasikan ke dalam genom sel non - membagi , yang merupakan fitur unik dari Lentivirus sebagai Retrovirus lain dapat menginfeksi hanya membagi sel . Genom virus dalam bentuk RNA adalah reverse- ditranskripsi ketika virus memasuki sel untuk memproduksi DNA , yang kemudian dimasukkan ke dalam genom pada posisi acak oleh enzim integrase virus . Vektor , sekarang disebut provirus a , tetap dalam genom dan diteruskan kepada keturunan sel ketika membagi . Situs integrasi tidak dapat diprediksi , yang dapat menimbulkan masalah . The provirus dapat mengganggu fungsi gen seluler dan menyebabkan aktivasi onkogen mempromosikan perkembangan kanker , yang menimbulkan kekhawatiran untuk kemungkinan aplikasi lentivirus dalam terapi gen . Namun, penelitian telah menunjukkan bahwa vektor lentivirus memiliki kecenderungan lebih rendah untuk mengintegrasikan di tempat-tempat yang berpotensi menyebabkan kanker daripada vektor gamma - retroviral . [ 9 ] Lebih khusus , satu studi menemukan bahwa vektor lentiviral tidak menyebabkan baik peningkatan kejadian tumor atau sebelumnya timbulnya tumor dalam strain tikus dengan kejadian yang jauh lebih tinggi dari tumor . [ 10 ] Selain itu , uji klinis yang digunakan vektor lentiviral untuk memberikan terapi gen untuk pengobatan HIV tidak mengalami peningkatan kejadian mutagenik atau oncologic .
Untuk alasan keamanan vektor lentiviral pernah membawa gen yang diperlukan untuk replikasi mereka . Untuk menghasilkan lentivirus , beberapa plasmid yang transfected ke apa yang disebut garis sel kemasan , biasanya HEK 293 . Satu atau lebih plasmid , umumnya disebut sebagai kemasan plasmid , menyandikan protein virion , seperti kapsid dan reverse transcriptase . Plasmid lain mengandung materi genetik yang akan disampaikan oleh vektor . Hal ini ditulis untuk menghasilkan RNA genom virus beruntai tunggal dan ditandai dengan kehadiran ψ ( psi ) urutan . Urutan ini digunakan untuk mengemas genom menjadi virion .Adenovirus [sunting ]Artikel utama: Adenovirus
Berbeda dengan lentivirus , DNA adenoviral tidak berintegrasi ke dalam genom dan tidak direplikasi selama pembelahan sel . Hal ini membatasi penggunaannya dalam penelitian dasar , meskipun vektor adenoviral kadang-kadang digunakan dalam percobaan in vitro . Aplikasi utama mereka dalam terapi gen dan vaksinasi . Karena manusia umumnya datang dalam kontak dengan adenovirus , yang menyebabkan pernapasan , pencernaan , dan infeksi mata , mereka memicu respon imun yang cepat dengan konsekuensi yang berpotensi berbahaya . [ 2 ] Untuk mengatasi masalah ini para ilmuwan sedang menyelidiki adenovirus yang manusia tidak memiliki kekebalan .Virus adeno terkait [ sunting]Artikel utama: virus Adeno terkait
Adeno terkait virus ( AAV ) adalah virus kecil yang menginfeksi manusia dan beberapa spesies primata lainnya . AAV saat ini tidak diketahui menyebabkan penyakit dan akibatnya virus menyebabkan respon imun yang sangat ringan . AAV dapat menginfeksi baik pemisah dan sel non - membagi dan dapat menggabungkan genom ke dalam sel inang . Fitur-fitur ini membuat AAV kandidat yang sangat menarik untuk menciptakan vektor virus untuk terapi gen . [ 1 ]
Selanjutnya, karena potensinya yang digunakan sebagai vektor terapi gen , para peneliti telah menciptakan AAV diubah disebut adeno terkait virus Self- komplementer ( scAAV ) . Sedangkan AAV paket untai tunggal DNA dan membutuhkan proses sintesis kedua untai , paket scAAV kedua untai yang anil bersama untuk membentuk DNA beruntai ganda . Dengan melompati kedua sintesis untai scAAV memungkinkan untuk ekspresi yang cepat dalam sel . [ 11 ] Jika tidak , scAAV membawa banyak karakteristik AAV rekan nya .Zat nanoengineered [ sunting]
Zat nonviral seperti ormosil telah digunakan sebagai vektor DNA dan dapat memberikan beban DNA sel khusus ditujukan pada hewan hidup . ( Ormosil singkatan dari silika organik diubah atau silikat . )Tantangan dalam aplikasi [sunting ]
Pemilihan vektor virus untuk menyampaikan materi genetik pada sel-sel dilengkapi dengan beberapa masalah logistik . Ada sejumlah vektor virus yang tersedia untuk digunakan terapi . Setiap vektor ini beberapa virus dapat menyebabkan tubuh untuk mengembangkan respon imun jika vektor dipandang sebagai penyerbu asing . [ 12 ] [ 13 ] Setelah digunakan , vektor virus tidak dapat secara efektif digunakan pada pasien lagi karena akan diakui oleh tubuh . Jika vaksin atau terapi gen gagal dalam uji klinis , virus tidak dapat digunakan lagi pada pasien untuk vaksin yang berbeda atau terapi gen di masa depan . Kekebalan yang sudah ada terhadap vektor virus juga bisa hadir pada pasien render terapi efektif bagi pasien tersebut. [ 12 ] [ 14 ] Hal ini dimungkinkan untuk melawan kekebalan yang sudah ada ketika menggunakan vektor virus untuk vaksinasi dengan priming dengan non vaksin DNA - virus , tetapi metode ini menyajikan beban lain dan hambatan dalam proses distribusi vaksin . [ 15 ] kekebalan Pra - ada juga ditantang dengan meningkatkan dosis vaksin atau mengubah rute vaksinasi